微观猎手：宏基因组二代测序（mNGS）在『疑难重症感染性疾病诊断』中的突破与希望

发布日期：2024-12-11浏览次数：

宏基因组二代测序技术（metagenomics next generation sequencing， mNGS）是一种新兴的高通量测序技术，可以直接对来自环境样本中的所有微生物的DNA或RNA进行测序，而无需预先培养这些微生物。这一技术的发展极大地推动了我们对复杂微生物群落的理解，并在多个领域得到了广泛的应用，其中一个应用领域与人类健康息息相关，那就是在人类感染性疾病中的诊断与耐药检测。 感染性疾病是威胁人类健康的主要疾病之一，世界卫生组织（World Health Organization，WHO）指出，全球每年约1500万人死于感染性疾病。此外，抗生素的耐药性问题也日益严重，至2050 年，抗生素的耐药性问题可能导致 3 亿人死亡。感染性疾病的快速精准治疗需要尽快明确病原微生物及抗生素的耐药性，然而，传统的诊断方法很大程度上依赖于培养来分离和鉴定病原微生物，难以满足临床需求。因此，感染性疾病的诊断迫切需要快速、精准的病原体检测技术。 mNGS的技术特征与临床应用 mNGS无需预设，能够直接对样本中所有的核酸序列进行高通量测序，一次性完成细菌、病毒、真菌和寄生虫等微生物检测。mNGS 不基于预先培养、富集或扩增且无偏倚的技术特点使其可以快速全面地鉴定出可能的致病病原体，除了目的靶标外，mNGS 也能覆盖到病原基因组的其他区域，获得更多的序列信息，用于溯源进化分析、预测病毒的传播模式和分析突变位点等，是一种高效的临床诊断工具。 从临床应用看，mNGS可用于中枢神经系统急性感染、中枢神经系统病毒感染、慢性中枢神经系统感染、血流感染、疑难呼吸道感染、呼吸道重症感染、腹腔感染、关节假体感染等。大量的临床研究也证实mNGS在罕见、新发病原体检测和多重病原体感染等临床应用场景中具有临床价值，mNGS 检测阴性结合临床症状有助于排除感染性疾病诊断。 2019年以来国内发布了多篇专家共识，概括来说，mNGS 的适应证主要包括： （1）危重感染； （2）免疫功能障碍； （3）难治性或既往疗效不佳的感染； （4）应用传统方法无法确定病原； （5）疑似新病原引起的感染； （6）群体性感染事件。 另外，mNGS技术可作为一种有用的工具可对免疫力低下者中致病微生物的核酸进行检测，解决其临床病原诊断相对复杂耗时（易感染，共感染，基于免疫检测的方法抗体反应弱）的问题。除此之外，mNGS在菌株分型、毒力与抗生素耐药基因检测、毒力判断、医院感染监测、社区传染性疾病暴发监测等方面具有巨大的潜力，可以为临床诊断及治疗提供高效精准的病原学依据。因此，在临床实践过程中，mNGS 正在改变着感染性疾病的诊治方式。 某研究用常规培养、呼吸道病原体核酸检测、NGS 3种方法对肺部感染患者不同样本（BALF、痰、肺组织、血液、胸腔积液）进行检测，结果显示NGS的检测阳性率远远高于其他两种检测方式 mNGS应用于感染性疾病的适应证 相较于传统检测技术，mNGS成本较高，因此目前各专家共识一般不对普通感染性疾病进行mNGS的推荐，推荐的mNGS适应证基本集中在一些疑难重症感染以及不明感染的辅助诊断上。此外，mNGS技术存在一定的局限性，对于来源于无菌部位的样本，mNGS能够对判断病原体提供价值较高的诊断证据；但当样本来自于肺部等有正常菌群定植的器官时，现有技术则不能准确鉴别定植菌和感染菌。而且mNGS无法区分检测到的病原菌的致病性状态。因此，mNGS检测结果并不能作为感染性疾病诊断的单一指标，在做出诊断和治疗决策前，一定要结合患者的病情，综合判断。 《宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病病原检测中国专家共识》 共识1：对常规微生物学检查容易明确病原体的感染，如尿路感染通过尿培养手段，不建议 mNGS。 共识2：患者表现为发热或发热症候群，病因未明确（符合不明原因发热定义），考虑感染或不除外感染，但规范性经验抗感染治疗无效，考虑应用常规技术检测的同时，或在其基础上，开展mNGS。 共识3：各种原因导致患者急危重症表现，不除外感染所致，或考虑继发或并发危及生命的严重感染，建议常规检测的同时，或在常规检测基础上，开展mNGS。 共识4：免疫受损患者疑似继发感染，常规病原学检查未能明确致病原或/和规范性经验抗感染治疗无效，建议进一步完善常规病原学检测的同时，或在其基础上，开展mNGS。 共识5：疑似局部感染，病原学诊断未明确、不及时处理则后果严重（危及生命或会导致局部功能不可逆性丧失）时，考虑常规检测的同时，或在其基础上，开展 mNGS。如眼部（角膜炎/溃疡、眼内炎、急性视网膜坏死等）、鼻部、耳部、喉部感染、糖尿病足、外伤累及深部组织等情况。 共识6：高度疑似感染性疾病，但病原学诊断未明确且常规抗感染治疗无效，建议进一步完善常规病原学检测、处理原发感染灶（如拔去导管、外科引流或拔去引流管、玻璃体切除）、调整经验抗微生物治疗方案的同时开展mNGS。 共识7：慢性感染，或慢性疾病不除外感染，尤其是二者临床表现相似、难以鉴别时，病情严重或抗感染治疗疗效不佳需要明确病因，建议在完善常规检测、调整经验治疗的同时开展mNGS。 共识8：除以上共识 2~7 之外的患者人群，不建议无条件普遍进行 mNGS 检测；进行 mNGS 检测前请感染病学和/或临床微生物学专家会诊。 共识9：不建议应用 mNGS 技术评估抗感染治疗效果。 共识10：针对微生物，考虑出现疑似新发病原体，或某特殊病原体，缺乏传统技术或传统技术手段不能确定种属时，建议常规检测的同时，或在其基础上，开展mNGS。 共识11：临床表现高度怀疑感染性疾病而多种传统技术反复检测不能明确致病微生物，但仍高度怀疑微生物所致，建议继续完善更多检测技术的同时或在其基础上，开展mNGS。 共识12：传统病原学检测的结果不能解释临床表现的全貌或/和抗感染治疗的反应，怀疑同时存在其他病原感染时，建议进一步完善更多检测技术的同时或在其基础上，开展mNGS。 共识13：感染性疾病的病原体已明确或高度怀疑某病原体，临床表现提示该病原体可能具有特殊的毒力表型，需要了解其毒力因子的相关信息时，可以考虑对感染相应临床标本进行 mNGS 物种鉴定的同时，采用mNGS检测毒力基因。 共识14：感染发生在正常有微生物定植的部位，或检测标本采集有污染时（如支气管肺泡灌洗液），不建议采用mNGS进行耐药性检测。 共识15：感染发生在正常无微生物定植的部位且标本采集过程污染概率低时，可以考虑采用mNGS进行物种鉴定的同时检测耐药基因，并通过耐药表型试验对耐药基因进行验证。对有菌种特异性的耐药性基因，在测序深度足够时，可以考虑应用 mNGS 检测获得性的耐药基因，预测耐药表型。 共识16：出现某种疾病的聚集性发病或暴发，怀疑是微生物导致的感染性疾病但病原不明，且常规快速检测无结果时，建议完善常规检测的同时或在其基础上开展mNGS明确致病微生物。 共识17：感染性疾病患者有特殊区域（如北美地区有某些致病性真菌）旅居史，或有特殊职业工作史（如畜牧业、屠宰业、水产业等），感染病原未明，建议常规手段检测的同时开展mNGS。 《中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识》 推荐意见１：若怀疑细菌、真菌、DNA、病毒、寄生虫、不典型病原体感染且需进行二代测序检测时，建议采用DNA检测；若怀疑RNA病毒感染时，则建议采用RNA检测（Ａ，Ⅱ）。 推荐意见２：对于临床疑似感染的病重、病危或免疫抑制、免疫缺陷患者，建议在完善传统实验室及分子生物学检测的同时，采集疑似感染部位的标本进行二代测序（Ｂ，Ⅱ）。 结语 宏基因组二代测序技术凭借其无偏倚、广覆盖、高通量和快速精准的优势，在临床诊断、微生物生态学研究和公共卫生等多个领域展现出巨大的应用潜力。未来，随着测序成本的降低和技术进步，mNGS有望在更多场景中发挥作用，进一步推动生命科学和医学的发展！ [1]刘静,闫莉莉,赵淑贤,等. 宏基因二代测序在肺部感染病原菌检测的应用 [J]. 安徽医科大学学报, 2023, 58 (06): 1046-1050. DOI:10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2023.06.029. [2]王成彬,高通量测序技术在临床感染性疾病实验室诊断中的应用.中华医学杂志,2023，103(15) : 1087-1091. DOI: 10.3760/cma.j.cn112137-20220915-01955 [3]中华医学会检验医学分会临床微生物学组,中华医学会微生物学与免疫学分会临床微生物学组,中国医疗保健国际交流促进会临床微生物与感染分会,宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病病原检测中国专家共识.中华检验医学杂志,2021，44(02) : 107-120. DOI: 10.3760/cma.j.cn114452-20201026-00794 [4]《中华传染病杂志》编辑委员会,中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识.中华传染病杂志,2020，38(11) : 681-689. DOI: 10.3760/cma.j.cn311365-20200731-00732 [5]赵聪琳,刘凯,周永召,靶向二代测序技术与宏基因组二代测序技术在病原微生物检测中的应用.中华预防医学杂志,2024，58(01) : 114-121. DOI: 10.3760/cma.j.cn112150-20230201-00072