mNGS：病原体感染检测困境的“破局者”

发布日期：2024-09-14浏览次数：

肺部感染（Pulmonary Infection）是指由包括细菌、真菌、病毒等各种病原体引起的包括支气管、肺泡和肺间质等肺实质性感染，其临床症状多为发热、咳嗽、咳痰、胸闷等，是世界范围内死亡和发病的主要原因。特别是在免疫功能低下者及老年人群中发病最为常见，治疗不及时会发展为重症肺炎、呼吸衰竭等，预后很差，病死率高，其中重症社区获得性肺炎（severe community-acquired pneumonia，SCAP）的院内死亡率更是可以达到50%以上。早期病原学诊断是实施精准抗感染治疗的基础，并且对患者的预后具有显著影响。因此，临床上快速、准确的检测和鉴定肺部感染的病原体进而对患者实行针对性治疗及其关键。 临床病原微生物检测的困境与突破 由于常规微生物学检测技术较慢，且检测率较低，PCR技术在部分医院未能开展，因此对于感染性疾病病原微生物诊断率较低，多数感染，尤其是重症感染，多选用经验性广谱覆盖治疗，易导致不能覆盖致病微生物、延误病情或医疗资源浪费。 近年来，宏基因高通量测序技术（met-agenomics next-generation sequencing，mNGS）越来越多应用于感染性疾病病原微生物的检测，其通过对病原微生物基因片段的高通量测序获得标本中病原体的遗传信息，敏感度高，耗时短，对常规检测难以检出的病原微生物更有优势，作为一种具有较高临床价值的新型分子诊断方法它能快速准确地检测血液、呼吸道、中枢神经系统、脓肿、局部组织和其他标本中的病原体，可为明确病原微生物提供直接证据，从而尽快给予有效治疗。mNGS在肺部感染、呼吸机相关肺炎、免疫受损宿主肺炎病原微生物诊断方面的优势亦有研究报道。 mNGS在细菌中的应用 细菌在肺部感染病原体占据重要地位，目前临床上最常用的检测方法是对分泌物等标本进行细菌培养，但培养的结果一般仅为常见的细菌，而对于特殊菌、罕见菌的效果欠佳。而mNGS是直接检测病原微生物的基因片段，并不依赖于对致病菌的培养验证，亦不受抗生素影响，能够检测更多种类的病原微生物，包括难以培养的微生物，这对于复杂感染和罕见病原体的诊断具有重要价值。大量的研究表明，mNGS对病原菌的检测阳性率高于传统培养法，弥补传统细菌培养的不足。 在一篇已公布的病例报告中（https://doi.org/10.3389/fmed.2022.755308）报道了 1 例考虑结核分枝杆菌感染的老年患者，经过血检、培养、支气管镜等结核相关检查均未检出结核分枝杆菌，为明确患者致病病原体对支气管肺泡灌洗液(Broncho Alveolar Lavage Fluid, BALF)行 mNGS 检测，检测结果不仅检出了结核分枝杆菌，还包括白色假丝酵母菌。该研究结果提示了 mNGS 在结核分枝杆菌检测中的潜力。 后续在另一个团队中，研究者们开展了对 311 例疑似和确诊肺结核患者的 BALF 标本进行了 mNGS 检测，并与包括结核 X-pert 检测、痰培养、抗酸杆菌染色等在内的常规病原微生物检测进行比较（https://doi.org/10.1016/j.ijid.2020.12.063）。他们发现在部分常规检测方法阴性的标本中，mNGS 可检测出结核分枝杆菌，这与其他研究报告的mNGS对结核分枝杆菌的检测高于结核 X-pert 的灵敏度相吻合。对于非结核分枝杆菌，已有相关研究报道了利用 mNGS 在肺部感染患者 BALF 中检测出的报道，这也是对常规检测方法的补充。 综上，与传统病原体检测相比，mNGS 不但在常见细菌的检测中占优势，还对罕见菌的检测有较大价值。 mNGS在真菌中的应用 近年来随着因病情等需要使用免疫抑制剂的高危人群增多，肺部真菌病的患病率呈明显上升趋势。人体肺部感染的真菌多为机会致病菌，且传统的检测方式耗时较长。 肺孢子菌和曲霉菌是引起人类肺部感染的常见真菌，在免疫抑制人群中为甚。如肺孢子菌易发生在 HIV 患者中引起肺孢子菌肺炎(Pneumocystis pneumonia, PCP)，但近年来关于非 HIV 型肺孢子菌肺炎确诊的患者逐渐增多。相关研究（https://doi.org/10.3389/fmed.2022.819425）对 4 份非 HIV 感染的肺孢子菌肺炎病例使用 mNGS 与传统检测方法进行比较，结果显示 mNGS 检测出肺孢子菌的时间明显短于传统检测方法。而对于曲霉菌，目前已有相关研究报道了与常规真菌检测方法相比 mNGS 能提高曲霉菌检出的阳性率。此外，有研究者利用mNGS 技术报道了非免疫功能抑制的患者也可能出现侵袭性肺曲霉菌。 综上，mNGS 在真菌感染中的诊断价值远大于传统检测方法。 mNGS在病毒中的应用 在临床工作中由病毒引起的肺部感染也并不少见，如鼻病毒、腺病毒、冠状病毒及呼吸道合胞病毒等。传统的病毒检测方法主要包括血清学试验(抗原和抗体检测)和核酸检测等，但这些检测方法均靶向特定病毒检测，病毒覆盖范围较小，而 mNGS 检测几乎可检测样本中所有的病原体，因此在病原检测中具有明显优势。一项研究报告（https://doi.org/10.1016/j.jmoldx.2019.10.007）的研究结果提示 mNGS 技术与病毒核酸 PCR 相比，mNGS 检测具有高灵敏度和高特异性。此外，他们利用 mNGS 技术还检测出了传统检测方法未检测到的病毒如丙型流感病毒等，但未检出病毒是否致病尚需要进一步研究。 因此，mNGS 在检测肺部病毒方面有很高的实用价值，这也在近些年的新冠病毒感染中发挥了巨大作用。 mNGS在特殊病原体中的应用 支原体、衣原体作为非典型病原体，也是肺部感染中常见的致病菌，尤其是支原体常引起儿童和青年肺部感染。一项研究（https://doi.org/10.1186/s12879-020-05085-5）利用 mNGS 技术对支原体感染肺炎患者进行早期诊断，为支原体感染患者早诊断、早治疗提供帮助。此外，有研究者发现 mNGS 可显著提高儿童重症支原体肺炎中混合感染的检出率，尤其是合并病毒的混合感染。同时 mNGS 对于衣原体感染也有应用价值，已有研究报道传统方法未检出但利用 mNGS 技术检测出鹦鹉热衣原体的病例，这提示 mNGS 在诊断鹦鹉热衣原体肺炎中的潜在优势。 mNGS在肺部混合性感染中的应用 肺部混合性感染是由多种致病微生物引起，其临床症状不典型，且肺部感染进展快、病情重、病死率高，为患者带来巨大的风险。而mNGS的病原体检测范围广泛，其无偏性测序对混合感染病原体的检出更具优势。 一项通过对 55 例混合性肺部感染患者进行分析的结果显示，mNGS 诊断混合性肺部感染的灵敏度远高于传统检测方式，这提示 mNGS 在诊断混合性肺部感染方面具有快速、准确的特点。此外，他们还发现 mNGS 能够检测出常规检测方法未检测出的病原体，另一个研究团队也报道了 mNGS技术鉴定出的病原体远多于传统培养方法，这也提示 mNGS 在多种病原体混合性感染诊断中的绝对优势。 mNGS的优势和局限性 优势： mNGS 在鉴别病原体过程无需预先设定目标病原体、不需要特异性引物、不受基因突变的影响，其检测周期短、检测范围广泛、灵敏度高，并且 mNGS 可鉴定病原体的分型及毒力基因检测。在治疗中与常规检测方式相比 mNGS 的检出率受抗生素的影响较小，不易因早期经验性使用抗生素导致病原体检测出现假阴性情况，且 mNGS 的结果可以指导抗生素的使用。此外，mNGS 对于耐药基因的检测在临床上也有一定进展，mNGS 可通过对微生物的基因组进行测序，评估耐药基因的多样性及抗性，进而为发现新的耐药靶点有指导意义，也对耐药菌群的新型敏感抗生素的研发具有重要的潜在价值。 局限： 1)数据库落后、不完整：mNGS 对病原微生物的鉴别能力主要取决于参考数据库的完整性，目前数据库中有大量已知微生物的序列信息，但仍需要精心设计并不断进行更新完善。 2)标本易污染：在 mNGS 标本从采集处理到送检过程中有许多步骤容易受到污染，如采样不规范、试剂盒污染等，这都会导致异常的结果偏差，最终影响临床医生判断。 3)结果解读问题：mNGS 检测出的病原微生物虽然较多，但目前还无法区分致病菌、定植菌和污染菌等，因此 mNGS 最终呈现的结果并不能直接采用，还需要临床医生结合患者症状、体征及辅助检查结果等综合进行判读。 4)检测价格昂贵：目前因为其检测成本，mNGS 价格仍较高，尤其是检测核酸遗传信息等对患者经济负担较重，难以在临床上普及。